فایل های دانشگاهی

بررسی میزان بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی به روش Real time PCR در بافت کبد موش های نرمال و چاق- قسمت ۱۰

ژن House-Keeping معمولاً ژنی است که در تمام رده های سلولی به میزان یکسانی بیان می شود و میزان بیان آن ارتباطی با میزان بیان ژن مورد بررسی ندارد. GAPDH، β-actin و HPRT از نمونه های معروف این دسته از ژن ها هستند(۲۱).
۳-۵-۲- فازهای مختلف یک واکنش real time PCR :
فاز اول که در آن گرچه همانند سازی به شکل تصاعدی انجام می شود، ولی به دلیل اینکه نور فلورسانتی که از نمونه ها نشر می شود کمتر از آستانه ی تشخیص Detector دستگاه می باشد در محاسبات دستگاه استفاده نمی شود و دستگاه آن را به عنوان خطا[۲۱] در نظر می گیرد.
مرحله ی دوم مرحله ای است که میزان نور فلورسنت نشر شده به آستانه ی تشخیص دستگاه رسیده و برای دستگاه قابل تشخیص می شود.
مرحله ی سوم فازی است که سرعت همانند سازی نمونه ها به دلیل تحلیل رفتن مواد واکنش و شرایط آن کم می شود(۵۲).
منحنی تکثیر یک واکنش Real time PCR در نمودار ۳-۱ نشان داده شده است.

نمودار ۳- ۱- فازهای مختلف واکنش تکثیر
[۲۲]

۳-۵-۳- روش‌های سنجش با Real-time PCR:
به طور کلی دو روش برای انجام این آزمایش وجود دارد:
روش غیر اختصاصی: که در آن از رنگ های فلورسنت مثل SYBR استفاده می شود که توانایی اتصال به اسید نوکلئید دو رشته را به صورت غیر اختصاصی دارد.
روش اختصاصی: که در آن ها از Probe ها استفاده می شود و یکی از معمول ترین روش های آن Taq-man probe است.
۳-۵-۳-۱- روش غیر اختصاصی سنجش با Real-time PCR:
همان طور که گفته شده در آن از رنگ های فلورسانتی مثل SYBR استفاده می شود که توانایی اتصال به DNA را به طور غیر اختصاصی دارند. این روش، روشی ارزان و آسان است، ولی یکی از معایب بزرگ آن اتصال غیر اختصاصی رنگ به محصولات دو رشته است به این معنی که رنگ متفاوتی بین دو رشته های پرایمر- دیمر و محصول هدف قائل نمی شود که این ممکن است در گزارش نتایج توسط دستگاه تداخل ایجاد کند. به این منظور باید شرایطی برای واکنش در نظر گرفته شود که حداقلِ شرایط برای تولید دیمر های پرایمری مهیا باشد. در این روش برای تغییر نتایج از آنالیز منحنی ذوب [۲۳]استفاده می شود (۷۳).
در این روش زمانی که DNA به صورت دو رشته نباشد SYBR از آن جدا است ولی در مرحله ی Annealing و تکثیر دو رشته، با ایجاد دو رشته و طویل شدن مطابق شکل ۳-۵، SYBR در دو رشته قرار می گیرد و توانایی نشر نور فلورسنت پیدا می کند.

[۲۴]
شکل ۳- ۵- اتصال SYBR به DNA
۳-۵-۴- مفهوم Threshold وCT[25]:
Threshold نشان دهنده میزانی از محصول است که در آن همه ی نمونه‌ها به صورت تصاعدی تکثیر می شوند(نمودار ۳-۲) این خط، باید تمام نمودارها را در فاز لگاریتمی قطع کند.همانند شکل ۷-۲ سیکلی را که در آن این خط منحنی PCR را قطع می کندCT می نامند.

نمودار ۳- ۲- Cycle threshold&Threshold
[۲۶]
۳-۵-۵- نحوه رسم منحنی ذوب (Melt Curve Analysis):
از مزیت های بسیار مهم Real time PCR ترسیم منحنی ذوب است که دستگاه این عمل را پس از اتمام فرایند PCR انجام می دهد و از آن به عنوان ژل Real time PCR یاد می شود.
از خصوصیات اصلی DNA، Tm[27] آن است که به عوامل مختلفی از جمله، طول قطعه، درصد GC و غلظت نمک در محیط بستگی دارد. از آنجا که SYBR توانایی اتصال اختصاصی به دو رشته را ندارد، از این روش برای شناسایی تنوع محصولات تکثیر شده در واکنش استفاده می شود. رسم منحنی ذوب توسط دستگاه به وسیله اندازه گیری میزان فلورسنت نشر شده از رنگ SYBR در دما های مختلف شکل می گیرد.
دستگاه به صورت اتوماتیک دما ی نمونه ها را در بازه های زمانی خاص به مقدار معینی تغییر می دهد و در هر دمای خاص میزان فلورسنت نشر شده را شناسایی و ضبط می کند. برای مثال دستگاه شروع به افزایش دما از دمای c°۶۰ می کند و در هر بازه ی زمانی خاص دما را یک درجه افزایش داده و میزان نور نشر شده را شناسایی می کند. این عمل تا رسیدن محصولات به دمای c°۹۲ ادامه می یابد.
با افزایش دما هرچه دو رشته بیشتر از هم جدا می شوند میزان SYBR های متصل به دو رشته کم شده و میزان نور نشر شده کمتر می شود. همزمان با این رویداد ها دستگاه منحنی ذوب را رسم می کند و Tm را که در آن %۵۰ دو رشته از هم جدا شده و %۵۰ آن هنوز دو رشته است با توجه به اعداد به دست آمده از افزایش دما تا c°۹۲، شناسایی کرده و گزارش می کند(۲۱).
در این منحنی هر پیک نمایانگر یک محصول با طول متفاوت و در نتیجه Tm متفاوت است.
نمودار ۳-۳ منحنی ذوب نمونه های B و A را نشان می دهد که وجود یک Tm پایین در آن نشان دهنده ی وجود پرایمر دیمر است.

[۲۸]نمودار ۳- ۳- منحنی ذوب

 

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت tinoz.ir مراجعه کنید.

 

۳-۵-۶- نحوه انجام Real time PCR:

 

نوع سنجش مورد نظر با دستگاه Real time PCR از نوع ABI step one و استفاده از روش SYBR green بود.
۳-۵-۶-۱- مواد لازم برای انجام Real time PCR:
Injection waterو سمپلــر، پنس، میکرو تیـوب ۵۰ میکرولیتــریcool box ، کیت primer design Master SYBR ، دستگاه ABI StepOne، لوله های مویینه(capillary tube)و درپوش آنها.

 

۳-۵-۶-۲- روش انجام آزمایشReal time PCR :

 

ابتدا در دو ویال ۲/۰ سی سی مواد زیر را به آرامی و روی یخ با سمپلر مخلوط شد.لازم به ذکر است که در این مطالعه برای همه پرایمرهای استفاده شده در واکنش Real-time PCR ،stock های ۱۰% از stock اولیه µl100 تهیه شد و سپس حجم های لازم از پرایمرها وارد µl20واکنش شد . همچنین در این مطالعه در هر µL از ‍cDNA به میزان ng15 نمونه وجود دارد.مواد لازم جهت انجام Real-time PCR در جدول ۳-۷ نشان داده شده اند.
جدول ۳- ۷ مواد لازم برای Real time PCR

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

رفتن به نوارابزار

بیرون رفتن

حجم

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *